基于红色荧光蛋白的酵母双分子荧光互补技术的建立
作者:宓庆坤; 商立民; 金超智; 原艳芝; 王建
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目的建立基于酵母细胞中酵母增强红色荧光蛋白(yEmRFP)的双分子荧光互补技术,用于直观检测蛋白质相互作用。方法采用分子克隆技术,将yEmRFP的N端片段(1~159aa、RN159)和C端片段(160~236aa、RC160)与转录因子Jun和Fos、碱性亮氨酸拉链结构域(bZIP)、bJun和bFos或他们的缺失突变体bfosZip融合,构建重组质粒,bFosZip和bJun之间没有相互作用,可以作为阴性对照组。重组质粒转化为酵母细胞后,通过营养缺乏培养基筛选成功转化的酵母菌落,并通过荧光显微镜和流式细胞仪检测酵母中重组yEmRFP蛋白质的荧光信号,以确定该技术是否可用于检测蛋白质的相互作用。结果成功构建了RN159和RC160与bJun和bFos或bfos-Zip融合的重组质粒。bJun和bFos在酵母表达系统中的相互作用使yEmRFP重新组装成一座完整的荧光蛋白质。显微镜下检测到红色荧光信号。流式细胞仪-藻红蛋白(PE)频道统计了20000个酵母细胞,其中约25%的酵母细胞具有红色荧光。然而,阴性对照组未检测到荧光信号,同样,通道中未检测到明显的红色荧光信号,表明系统没有自发激活。结论基于yEmRFP的酵母双分子荧光互补技术已成功开发,可用于蛋白质相互作用的直观、快速检测和筛选。